血漿蛋白有助于改善仔豬腸損傷并降低輪狀病毒感染副作用

發布人：管理員 時間：2012-08-08

薛曉潔、熊呈編譯，選自營養生化之旅

美國北卡羅萊納州立大學動物科學學院

 

摘要：輪狀病毒會感染絕大多數哺乳動物類新生兒并導緻腹瀉，資料顯示每年有近80萬的新生動物死于這種病毒。由于血漿蛋白含有生物活性的功能成分，能夠大大提高動物抵抗力如抗病原體等；本實驗選取感染輪狀病毒的仔豬作為研究對象來評估血漿蛋白對動物腸道影響；采用2乘2的析因設計，配方分為兩組：配方一添加血漿蛋白組及配方二添加大豆蛋白組；實驗對象分為輪狀病毒感染仔豬和健康仔豬，試驗旨在于對比兩組配方是否可以仔豬腸損傷并抵抗輪狀病毒感染。所有感染動物排出的糞便中亦攜帶輪狀病毒；實驗表明配方一病毒感染仔豬在感染後前三天生長速度與健康仔豬相同且無痢疾症狀；配方二病毒感染仔豬生産速度劇減。病毒感染第三天，腸内絨毛長度與絨毛長度與腸腺深度比會降低；然而此時血漿蛋白可以有效削弱輪狀病毒對仔豬小腸的負面影響。相比配方二，配方一組病毒感染的豬體内可以維持更高水平的腸粘膜蛋白且總乳糖酶活性。血漿蛋白所含有的生長因子有助于加快康複速度及病毒結合蛋白，降低小腸的負重。以上數據及其他有關血漿抑制動物痢疾的實驗數據表明血漿蛋白粉可以明顯改善動物新生兒腹瀉症狀。

 

關鍵詞：輪狀病毒；仔豬；血漿蛋白；小腸健康

 

1、引言

   全世界每年大概有2,500,000嬰幼兒死于痢疾，盡管近三十年來死亡率有所下降，但發病率未曾變化。引起嚴重痢疾的主要原因是輪狀病毒，每年此類死亡病例高達600,000至800,000。美國政府每年用于治療嬰幼兒輪狀病毒引發疾病的治療費用遠遠高出10億美金，而且輪狀病毒在鳥類和哺乳動物群體中也相當普遍，感染模式與人類感染近似。

輪狀病毒會感染腸上皮細胞，直接破壞腸内粘膜層。病毒粒子在腸上皮細胞内繁殖，導緻感染細胞溶解，腸内絨毛反應遲鈍甚至退化。消化不良型痢疾一般表現為凹陷/扁平腸雙糖酶和水性腹瀉，并伴随有脫水現象。總的來說正常絨毛結構的損失會影響營養攝取，可能會導緻發育停滞。

   通常情況下，商業化農場中的斷奶仔豬斷奶後會經曆腹瀉，由此導緻仔豬生長性能下降、死亡率升高。如果堅持飼喂斷奶仔豬血漿蛋白（添加量為2%-5%）可以幫助仔豬克服斷奶應激，提高其采食量和生長性能；增強仔豬自身的抗病毒免疫能力。上述發現表明血漿蛋白有助于提高惡劣飼養環境下仔豬的生長健康。

  近期一項報告表明用濃縮牛血清飼喂隐孢子蟲病毒感染的牛犢可以有效的降低腹瀉量和腸道通透性，從而加快腸道康複；飼喂血漿蛋白的大腸杆菌K88感染仔豬不僅快速的擺脫痢疾幹擾，而且腸道炎症也有所減輕。上述兩項研究發現促使我們進行新的實驗，來評估血漿蛋白是否可以降低輪狀病毒帶來的仔豬小腸損傷并快速康複。

 

 

2.實驗對象及實驗方法

2.1.動物保健

  實驗過程所涉及的動物均經由美國北卡羅萊納州立大學審核通過。實驗對象分兩組，每組5頭母豬，在預産期前兩天注射12.5mg的PGF2a引産。分娩時直接從産道取出仔豬，然後使用70%的乙醇溶液清洗消毒并置于清潔飼養箱内。仔豬單獨圈養（籠長0.5米；寬0.3米；高0.4米），房間溫度可調控控制在32°；仔豬通過重力進給系統随意采食，出生後2小時内提供被動免疫，24小時内飼喂初乳；飼喂設備及豬籠每天清潔兩次。

 

2.2.試驗設計

64頭小豬根據不同胎劃分，并按照2*2的析因設計分為四組。依照仔豬是否感染輪狀病毒把其分至不同的房間，實驗組配方一中血漿蛋白蛋白的添加比為15%；對照組配方二即添加大豆蛋白組除乳糖外，不含任何動物源性産品。然而兩組配方的能量、蛋白、脂肪、乳房和必需氨基酸等含量接近一緻；由于大豆蛋白與血漿蛋白的氨基酸構成不同，因此配方二中加入晶體狀氨基酸來補充。飼料與水的摻兌比為150g/L,幹物質含量約為12%；配制後低溫儲存（4℃）。為了降低飼料污染并保證仔豬可以任意采食，每天分為在8：00、13：00、18：00和23：00四個時段供給新鮮飼料。

  四天後，根據實驗設計仔豬受到輪狀病毒感染（0或107）；将輪狀病毒和假性接種物混合溶液20ml使用8F胃管強制飼喂仔豬。注射前6小時不供給仔豬日糧，強制飼喂3小時後再次供給不同日糧直至實驗結束。每天由專人觀察并記錄仔豬糞便情況，0級表明糞便正常、1級表示糞便較稀、2級表示糞便過稀、3級表明嚴重水瀉。每日實驗員使用棉簽直接擦拭仔豬直腸以鑒定輪狀病毒是否脫落。簡明地講，打開動物腹腔将胃腸道從胃食管連接處移至直腸末端；将空腸、回腸與十二指腸分開，将胃、腸系膜從腹腔感染部位移至回盲連接處。大緻回腸中部位置，去除兩段相鄰長度約為3cm和10cm的；為測定乳糖生物活性，稱取10cm腸道片段置于10mM的磷酸鹽溶液中緩沖；同時選取3cm腸内部分作組織分析（10%福爾馬林，70%酒精，5%的酸化劑，15%的水）。

 

2.3.分析方法

将直腸刮取物置于2ml的磷酸鹽溶液（10Mm、PH 7.5）并輕微振蕩，添加5ml凝聚酶至載玻片上樣品（10µl）。4分鐘後目測凝聚效果，同樣分為四個等級，分别為0無凝集、1微量凝集、2适量凝集、3大量凝集，分别代表輪狀病毒脫落的程度。

用作組織分析的腸道片段經處理後用蘇木紫和曙紅染色，借助計算機輔助形态系統由專人用光鏡觀察選取的腸内片段形象變化，測定每個樣品4組定向絨毛的絨毛長度與腸腺深度。根據Dahlqvist描述的方法來分析腸内乳糖活性，之前Bradford也就黏膜勻漿的蛋白質含量做過相關分析。

 

2.4.統計分析

  利用SAS一般線性模型程序進行數據雙向分析，仔豬作為實驗對象。該模型主要包括不同蛋白原料、輪狀病毒對實驗對象的影響及兩者的相互作用。

 

3.實驗結果

    輪狀病毒感染前3天，配方治療效果及感染副作用對仔豬采食量的影響無差别；從第3天至實驗結束，不考慮輪狀病毒感染的前提下，配方一組仔豬的采食量要比配方二組高出30%；如果不考慮配方，3-14日感染病毒的仔豬和健康仔豬的采食量相當。然而配方一組病毒感染的豬采食量要遠遠大于配方二組的感染豬群(表1)。在感染後的前3天，配方二組的感染仔豬平均日增重有所下降，隻有配方一組感染仔豬日增重的56%。第3天至14天，不考慮感染情況，配方二組的豬增重遠遠大于配方一組。

病毒感染前或整個實驗期間健康豬均無觀察到輪狀病毒脫落情況發生，然而感染後24小時，即可觀察到仔豬體内輪狀病毒脫落；并在感染後4到5天達到最大值。不考慮配方分組，感染仔豬病毒脫落數量相當。

每日觀察記錄痢疾程度，配方一組感染豬群痢疾分值較高（表二）；感染當天此類豬群嚴重腹瀉，并且痢疾分值至感染第7日居高不下，第5日分值達到最高。整個實驗過程中，配方二組感染豬群表現良好，與健康仔豬無差異。感染第8日，配方二組感染豬群恢複正常，第3日，不考慮感染情況配方一組豬群糞便幹物質成分要高于配方二組。

   為了評估腸道結構，對感染3日和14日的回腸形态進行觀察分析；不考慮配方組，感染3日後感染豬群腸道絨毛高度變低（0.0506vs.0.713±0.042mm,p＜0.002),且絨毛與腸腺深度比也有所下降（3.17vs. 4.49±0.31，p=0.004）；配方一組中豬群的腸道絨毛長（0.674vs.0.544±0.042mm，p=0.03）和絨毛與腸腺深度比（4.32vs.3.34±0.31,p=0.03）都要高于配方一組。感染後3日（p=0.43）豬群的腸腺深度無差異，而且感染後14日腸道絨毛長度、腸腺深度（p=0.43）及絨毛腸腺比（p=0.43）也無差異。

接下來将感染後3日和14日内腸粘膜重量、蛋白含量及回腸乳糖活性具體量化以評估腸道的消化能力（表2）；不考慮配方影響，感染3日内腸粘膜重量及蛋白含量有所下降，同時腸道内乳糖活性也會降低。不考慮感染狀況，配方一組中豬群的腸粘膜蛋白含量和乳糖活性相對較高；另外配方一組的感染豬群腸粘膜蛋白含量也高于配方二組。感染14日内盡管配方二組的健康豬群乳糖活性低于另外三組，然而配方組之間對生化情況無太大影響。

 

4.讨論

 

   1999年輪狀病毒疫苗研發成功，然而由于它會帶來腸套疊症狀這種疫苗很快就從市場上撤回。不久後，新疫苗研制成功，能夠有效預防輪狀病毒腹瀉。對上述兩種疫苗的功效和安全性能進行實驗研究，腸套疊和安慰劑沒什麼兩樣。另外經發展中國家的臨床試驗證實兒童在惡劣條件下接受疫苗也會有相似的反應，原因是這種環境下種種因素會降低疫苗的作用。當前适用于各種輪狀病毒引發疾病的疫苗尚未研發出來，科研人員利用仔豬模式一直在進行治療輪狀病毒的新思路。之前曾使用輪狀病毒腸炎模式來證實營養不良會延緩康複速度。根據先前的實驗結果得知血漿可以提高高病原體發生期仔豬的生長性能，并克服仔豬斷奶應激；因此血漿被選作一種新的營養配料，它富含免疫球蛋白，生物活性因子及小肽等功能性蛋白成分，而且該實驗可以觀察到輪狀病毒感染急性期血漿蛋白對腸道損傷的作用，大大提高了仔豬的成活率及生長性能。

  實驗中配方二組，即飼喂血漿蛋白的病毒感染豬群，在感染後3日内生長速度遠遠大于配方一組。前期報告顯示血漿蛋白良好的适口性可以大大提高仔豬斷奶期間的采食量；最新報告表明血漿蛋白可以通過降低氨基酸的分解代謝來提高配方中蛋白利用率。此次實驗為了與血漿蛋白氨基酸構成保持一緻，我們在大豆蛋白配方組補充适量晶體氨基酸來平衡。感染後3日内，飼喂血漿蛋白的健康豬群的采食量、增重都遠遠大于配方一組的健康仔豬。

食用血漿蛋白之後，仔豬腸道和痢疾情況明顯好轉，血漿蛋白大大降低了輪狀病毒對腸道絨毛及腸腺的副作用，并且腸粘膜蛋白含量和腸道總乳糖活性也高出飼喂豆類蛋白的豬群。另外感染大腸杆菌的仔豬飼喂血漿蛋白可以降低對腸内上皮組織損傷程度，因此血漿蛋白不僅僅可以改善病菌感染期間動物腸道的健康狀況，亦能保證動物采食量及生長速度。 

 

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